表 琼脂糖浓度与DNA分离范围

2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
    不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。
3、电泳方法
（1）凝胶类型
    用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板*浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。
（2）缓冲液系统
    缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。
常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L（pH7.5~7.8）。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。
TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。
（3）凝胶的制备
    以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。
（4）样品配制与加样
    DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25％溴酚蓝或其他指示染料，含有10％-15％蔗糖或5％~10％甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5％Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）电泳
    琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的zui大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。
    电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5％时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。
（6）染色和拍照
    常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。

SDS-PAGE胶制备

一. 实验原理：
SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
二. 试剂和器材：
试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl（pH6.8）,5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10％过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. pH8.3 Tris-*电极缓冲液：称取Tris 6.0g，*28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70％的过氯酸，zui后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

三. 实验操作；
（一）样品制备
将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。
（二）分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH₂O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；
3 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；
ddH₂O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH₂O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;
8 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.
9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至*脱净。